微生物培养构建：面向全球实验室与研究人员的综合指南

微生物培养是科学研究中众多学科的基础工具，涵盖基础研究、生物技术、环境科学和临床诊断等领域。成功地 体外 培养微生物的能力对于研究其特性、进行实验和开发新应用至关重要。本综合指南提供了关于微生物培养构建和维护的原理与实践的详细概述，重点关注面向全球实验室的最佳实践、故障排除和安全考量。

理解微生物培养

什么是微生物培养？

微生物培养是通过在预先确定的培养基中，在受控的实验室条件下让微生物繁殖来增殖微生物的方法。微生物包括细菌、真菌、病毒、原生动物和藻类。培养物可以是纯培养物，仅含有一种类型的微生物；或混合培养物，包含多种物种。

微生物培养的重要性

• 研究：研究微生物的生理、遗传和行为。
• 诊断：识别临床样本中的病原体。
• 生物技术：生产药物、酶和其他有价值的产品。
• 环境科学：分析土壤、水和空气中的微生物群落。
• 教育：传授基础微生物学技术。

必备设备和材料

建立成功的微生物培养实验室需要一系列专业设备和材料：

• 培养箱：维持稳定的温度和湿度以促进微生物最佳生长。二氧化碳培养箱常用于需要控制二氧化碳水平的真核细胞培养。
• 高压灭菌器：使用高压蒸汽对培养基、设备和废弃物进行灭菌。
• 层流罩（生物安全柜）：为处理培养物提供无菌环境，最大限度地降低污染风险。不同级别的生物安全柜（一级、二级、三级）为使用者、样品和环境提供不同级别的保护。
• 显微镜：观察微生物形态并评估培养物的纯度。相差显微镜对于观察活的、未染色的细胞特别有用。
• 摇床/搅拌器：为液体培养物提供通气和混合，促进均匀生长。
• 移液器和微量移液器：精确转移液体。
• 培养皿和培养管：分别用于固体和液体培养物的容器。
• 无菌拭子和接种环：转移和划线接种培养物。
• 生长培养基：为微生物生长提供营养。
• 个人防护装备 (PPE)：手套、实验服、眼部防护和口罩，以确保个人安全。

生长培养基的类型

生长培养基的选择对于成功培养微生物至关重要。培养基可根据其成分、稠度和用途进行分类。

按成分分类

• 定义培养基（合成培养基）：包含精确已知的化学成分。用于研究特定的营养需求。 示例：大肠杆菌的M9最小培养基。
• 复杂培养基（天然培养基）：包含化学成分未知的成分，如酵母提取物、蛋白胨或牛肉提取物。提供广泛的营养物质，支持许多微生物的生长。 示例：营养肉汤或Luria-Bertani (LB) 肉汤。

按稠度分类

• 固体培养基：包含固体剂，通常是琼脂。用于分离纯培养物和观察菌落形态。 示例：营养琼脂或MacConkey琼脂。
• 液体培养基（肉汤）：不含固体剂。用于大量培养微生物。 示例：胰蛋白酶大豆肉汤 (TSB)。
• 半固体培养基：含有低浓度琼脂（通常<1%）。用于运动性测试。

按用途分类

• 选择性培养基：包含抑制某些微生物生长而允许其他微生物生长的成分。用于从混合群体中分离特定类型的微生物。 示例：MacConkey琼脂（选择革兰氏阴性菌）或甘露醇盐琼脂 (MSA)，它通过甘露醇发酵选择葡萄球菌，并区分金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌。
• 鉴别培养基：包含允许根据代谢活动区分不同类型微生物的成分。 示例：血液琼脂（根据溶血性区分细菌）或伊红美蓝 (EMB) 琼脂，它区分大肠杆菌（金属绿色光泽）和其他coliform细菌。
• 富集培养基：包含特定的营养物质，促进特定微生物的生长，使其能在样品中比其他生物具有竞争优势。当目标生物数量很少时使用。示例：亚硒酸盐肉汤，用于富集沙门氏菌。

示例：为大肠杆菌培养选择合适的培养基 要培养大肠杆菌的一般培养物，通常使用LB肉汤或琼脂。如果您想选择能发酵乳糖的大肠杆菌菌株，可以使用MacConkey琼脂。如果您正在研究特定的代谢途径，可以使用M9等定义培养基来控制可用的营养物质。

构建微生物培养的步骤

构建微生物培养的过程通常包括以下步骤：

1. 生长培养基的制备

根据制造商的说明或既定的实验室规程制备合适的生长培养基。这通常包括：

• 称量所需的成分。
• 在蒸馏水或去离子水中溶解成分。
• 将pH调节至所需水平。
• 添加琼脂（如果制备固体培养基）。
• 通过高压灭菌对培养基进行灭菌。

关键考量：

• 准确性：精确的测量对于可重复的结果至关重要。使用校准的平衡器和量器。
• 无菌性：确保所有培养基成分和制备容器均无菌，以防止污染。
• pH调节：使用校准的pH计验证培养基的pH。大多数细菌在中性pH（约7.0）附近生长最佳。真菌通常偏好微酸性条件。

2. 灭菌

灭菌对于消除任何可能污染培养物的非期望微生物至关重要。常见的灭菌方法包括：

• 高压灭菌：使用121°C的高压蒸汽进行15-20分钟。这是灭菌培养基、设备和废弃物最常用的方法。
• 过滤灭菌：将液体通过足够小的孔径（通常为0.22 μm）的过滤器以去除微生物。用于不能高压灭菌的热敏溶液。 示例：灭菌抗生素溶液。
• 干热灭菌：在160-180°C下加热1-2小时。用于灭菌玻璃器皿和其他耐热物品。
• 化学灭菌：使用乙醇或漂白剂等化学消毒剂对表面和设备进行灭菌。

高压灭菌的最佳实践：

• 确保高压灭菌器得到正确维护和校准。
• 不要过载高压灭菌器。
• 使用适当的容器高压灭菌液体，以防止溢出。
• 在打开高压灭菌器之前，让其完全冷却，以防烫伤。

3. 接种

接种是将所需的微生物引入无菌生长培养基的过程。根据接种物来源和培养物类型，可以使用各种技术进行。

• 从纯培养物：使用无菌接种环或拭子将少量现有培养物转移到新培养基中。
• 从混合培养物：通过划线分离在固体培养基上分离单个菌落。
• 从临床样本：用拭子取样到培养基上，或将样本悬浮在液体培养基中。
• 从环境样本：使用系列稀释和涂布技术以获得可计数菌落。

划线分离技术： 此技术用于从混合细菌群体中获得纯培养物。它包括通过反复在固体琼脂平板表面划线来稀释细菌样品。目标是获得分离良好的菌落，每个菌落都来自单个细菌细胞。

示例：大肠杆菌的划线分离 1. 将接种环在火焰中烧至红热，然后冷却。 2. 将接种环浸入含有大肠杆菌的样品中。 3. 将接种环在琼脂平板的一个区域上划线。 4. 再次烧灼接种环并冷却。 5. 从第一区域划线到第二区域，带走一些细菌。 6. 重复烧灼和划线过程，进行第三和第四区域。 7. 在37°C下培养平板24-48小时。分离的菌落应在划线的后半部分形成。

4. 培养

培养涉及提供微生物生长的适当环境条件。这通常包括控制：

• 温度：大多数细菌在37°C（人体温度）下生长最佳，但有些可能需要较低或较高的温度。真菌通常偏好较低的温度（25-30°C）。
• 大气：某些微生物需要特定的气体条件，例如氧气的存在或不存在，或高浓度的二氧化碳。需氧细菌生长需要氧气，而厌氧细菌则无法耐受氧气。
• 湿度：保持足够的湿度以防止培养基干燥。
• 时间：培养时间因微生物和培养基而异。细菌通常比真菌生长得快。

培养考量：

• 温度控制：使用校准的培养箱以确保精确的温度控制。
• 大气控制：使用厌氧罐或二氧化碳培养箱来创造特定的气体条件。
• 监测：定期监测培养物的生长和污染情况。

5. 监测与维护

定期监测对于确保培养物正常生长并保持无污染至关重要。这包括：

• 目视检查：检查生长迹象，如液体培养物的浊度或固体培养物上的菌落形成。
• 显微镜检查：观察细胞形态并评估培养物的纯度。革兰氏染色是区分细菌的常用技术。
• 继代培养：将一部分培养物转移到新鲜培养基中，以维持活力并防止营养耗尽。
• 储存：通过冷冻或冻干（冷冻干燥）来保存培养物以长期储存。

无菌技术：防止污染

无菌技术是一套旨在防止培养物污染和维持无菌环境的程序。无菌技术的关键原则包括：

• 在层流罩中工作：提供无菌工作空间。
• 灭菌设备：烧灼接种环和接种针，高压灭菌培养基和玻璃器皿。
• 使用无菌耗材：使用预灭菌的一次性耗材或在使用前对可重复使用的耗材进行灭菌。
• 最小化暴露于空气：快速高效地工作，以尽量减少培养物暴露于空气的时间。
• 正确的洗手：在处理培养物前后彻底洗手。

无菌技术实践示例：

• 打开无菌培养皿：只稍微提起盖子，以尽量减少暴露于空气。
• 转移培养物：在转移培养物之前和之后，对培养管的管口进行火焰灭菌。
• 制备培养基：使用无菌水和玻璃器皿，并在制备后立即对培养基进行高压灭菌。

常见问题故障排除

尽管进行了细致的计划和执行，但在构建微生物培养时有时会遇到问题。以下是一些常见问题及其潜在解决方案：

• 无生长：
  • 可能原因：生长培养基不正确、培养温度不正确、接种物失活、存在抑制剂。
  • 解决方案：验证生长培养基是否适合微生物，检查培养温度，使用新鲜接种物，并确保培养基中不存在抑制剂。
• 污染：
  • 可能原因：无菌技术不良、培养基或设备污染、空气污染物。
  • 解决方案：回顾并加强无菌技术，对所有培养基和设备进行适当灭菌，并在层流罩中工作。在培养基中使用抗生素或抗真菌剂（如适用）以抑制污染物生长。
• 生长缓慢：
  • 可能原因：亚最佳生长条件、营养耗尽、有毒副产物积累。
  • 解决方案：优化生长条件（温度、大气、pH），提供新鲜培养基，并对培养物进行通气以去除有毒副产物。
• 混合培养物：
  • 可能原因：原始接种物污染、划线分离不完全。
  • 解决方案：从可靠来源获取纯培养物，重复划线分离，并使用选择性培养基抑制不需要的微生物生长。

安全考量

使用微生物需要遵守严格的安全规程，以保护人员并防止潜在有害生物释放到环境中。

生物安全等级

微生物根据其致病潜力分为生物安全等级（BSLs）。每个BSL都需要特定的遏制措施和安全设备。

• BSL-1：已知不会对健康成年人造成疾病的微生物。 示例：枯草芽孢杆菌。 需要标准的微生物学实践和PPE。
• BSL-2：对健康成人具有中等疾病风险的微生物。 示例：金黄色葡萄球菌。 需要BSL-1实践加上限制访问、生物危害警示标志和锐器预防措施。应在生物安全柜中进行气溶胶操作。
• BSL-3：可能通过吸入引起严重或潜在致命疾病的微生物。 示例：结核分枝杆菌。 需要BSL-2实践加上受控访问、定向气流和呼吸防护。所有操作都必须在生物安全柜中进行。
• BSL-4：非常危险且对危及生命疾病构成高风险的微生物。 示例：埃博拉病毒。 需要BSL-3实践加上完全隔离、专用通风系统和全身防护服。

一般安全实践

• 穿着合适的PPE：手套、实验服、眼部防护和口罩。
• 注意手部卫生：在处理培养物前后彻底洗手。
• 对工作表面进行消毒：在使用前后用合适的消毒剂对表面进行消毒。
• 妥善处理废弃物：对受污染的废弃物进行高压灭菌或焚烧。
• 报告溢出和事故：遵循既定的溢出报告和清理规程。
• 接受适当的培训：确保所有人员都接受过微生物学技术和安全规程的培训。

长期培养物保存

为长期储存保存微生物培养物对于维护有价值的菌株和避免反复分离和培养生物体至关重要。常见的保存方法包括：

• 冷藏：在4°C下储存培养物，用于短期保存（数周至数月）。
• 冷冻：在-20°C或-80°C下，在甘油等低温保护剂中储存培养物。此方法可保存培养物数年。
• 冻干（冷冻干燥）：通过冷冻然后真空干燥去除培养物中的水分。此方法可保存培养物数十年。

冷冻培养物的最佳实践：

• 使用低温保护剂以防止冰晶形成，冰晶会损害细胞。甘油是常用的低温保护剂。
• 缓慢冷冻培养物，使水从细胞中逸出。使用程序控制的冷冻器，或将培养物在-20°C冰箱中放置数小时，然后转移到-80°C。
• 将冷冻的培养物储存在带有密封盖的低温管中。
• 在试管上清楚标明菌株名称、冷冻日期和其他相关信息。

结论

构建和维护微生物培养物是全球研究人员、临床医生和教育工作者的基本技能。通过理解无菌技术原理、选择合适的生长培养基和实施适当的安全规程，您可以成功培养微生物以满足各种应用需求。本指南为构建您的微生物培养技术专长并为各个科学领域的进步做出贡献提供了全面的基础。请记住，持续的实践、对细节的一丝不苟以及对安全的承诺是获得可靠且可重复结果的关键。